在医学和生物学研究中，全息显微成像技术具有巨大的应用价值，比如研究细胞结构、追踪药物在细胞内的作用过程，甚至在单分子水平上研究蛋白质等生物大分子的动态行为。该技术的一个显著优势是灵敏度高，由于它能够检测到非常微弱的光信号变化，因此适用于观察低对比度的生物样品。
全息显微成像技术通常将激光分成两部分，其中参考光直接照射在全息记录介质上，而物光则照射在需要观察的样品上。物光照射在样品后发生散射，并携带上样品的各种结构信息。然后，散射光与参考光在空间相遇并发生干涉，由此产生的干涉图样被记录在全息记录介质上。全息技术就像是一把钥匙，借助数学计算和特殊的光学处理，人们可以从这个复杂的图案中提取出清晰的三维图像。
近日，牛津大学研究团队利用非共路径几何结构的暗场散射显微镜，实现了对单个蛋白质的高灵敏度光学全息成像，在散射截面方面的灵敏度比最先进的全息方法提高了五个数量级。这一技术不仅极大地提高了对生物分子质量的测量精度，而且还能够独立测量样品的振幅和相位信息，为生物分子的结构、动态和相互作用研究提供了新的工具。该成果以“Single-protein optical holography”为题发表于Nature Photonics。
光学显微技术在生物医学研究中扮演着至关重要的角色，尤其是在对微小生物结构的成像和分析方面。然而，传统的光学显微镜技术在分辨率和灵敏度上存在限制，特别是在对单个生物分子进行成像时。近年来，光学全息技术因其能够提供高对比度和三维成像的能力而受到广泛关注。尽管全息技术在提高成像灵敏度方面取得了显著进展，但大多数现有技术基于共路径干涉仪，以至于限制了对参考场和散射光场的独立调控，从而阻碍了全息成像技术在生物分子探测中的应用。
研究人员构建了一个全内反射光学正交显微镜(图1)，通过在参考臂和散射臂中引入不同的相位移，将散射光和参考光分离到四个并行的检测通道中，实现了迄今为止仅在共路方法中报道过的单分子灵敏度。该方法的优势在于全内反射照明增强了界面处的照明场强，抑制了距离界面几百纳米以上物体的散射，有效降低了样品诱导背景。更重要的是，散射光和参考光的相对振幅可以轻易调整，以匹配成像相机在所需读出速度下的全井容量以及样品的预期散射截面。而且，尽管是非共路径几何结构，但该方法具有固定的相位稳定性，从而获得优异的整体相位稳定性。
图1 全内反射光学正交显微镜
实验中，研究者团队利用金纳米粒子(AuNPs)验证了全息成像方法。他们通过对比暗场显微镜和全息成像的结果，证明了其能够准确地提取散射强度。此外，通过散射/照明臂中的压电驱动镜以线性方式暂时改变散射臂和参考臂之间的相位，研究团队记录了AuNPs的时间变化视频，展示了振幅和相位的精确解耦。这一结果表明，该技术能够有效地区分和测量样品的振幅和相位信息，为后续的生物分子分析提供了重要基础。
图2 单分子蛋白质全息显微技术
随后，研究团队将这一技术应用于单个蛋白质的成像。他们使用了一种名为DynΔPRD的90 kDa蛋白质，凭借全息显微成像技术成功地检测到了蛋白质与玻璃表面的结合过程。通过对该过程的分析，他们不仅能够测量蛋白质的质量，还能够通过相位信息推断出蛋白质的空间取向。除此之外，研究人员还展示了如何通过调整参考光和散射光之间的相位差来优化成像对比度，并通过后处理优化焦点，从而使得研究者能够在不牺牲成像质量的情况下，对单个蛋白质进行精确的质量和结构分析。
该研究的成功不仅在于开发了一种高灵敏度全息显微成像技术，更在于它为生物分子的结构和动态研究提供了新的视角。通过独立检测样品的振幅和相位信息，人们能够以更高的精度和灵敏度对单个生物分子进行成像和分析。这一技术对于理解生物分子的功能和相互作用机制、揭示疾病的分子基础以及开发新的药物疗法都具有重要意义。
