由于衍射的原因，现有的单分子检测方法的测试体积无法进一步减小，它们仅限于超稀释或分子固定化。当下需要研究更加先进的单分子方法，以更好的研究分子的动态作用的能力。
基于此，香港科技大学化学系助理教授黄晋卿所带领的研究团队结合光学等离子体操纵和表面增强拉曼光谱(SERS)测量设计出一种单分子平台，能够在溶液中实现高效率、高通量的单分子表征，有望揭示生理浓度下pH依赖性胰淀素的异质结构以及2型糖尿病患者健康的隐藏分子机制。该成果以“Efficient optical plasmonic tweezer-controlled single-molecule SERS characterization of pH-dependent amylin species in aqueous milieus”为题发表在nature communications上(www.doi.org/10.1038/s41467-023-42812-3)。
因为光学等离子体和表面增强拉曼光谱都是表面敏感的，借助于纳米结构的衬底，它们的集成克服了光学衍射极限，限制了等离子体纳米腔的位置，并减少了SERS主动检测体积，从而实现了持续的高SERS增强。研究团队表示，他们所设计的单分子检测平台有效解决了表征水环境中异质混合物中单分子的挑战。而且，该平台可以在单分子水平上检测自由扩散的分析物，而无需分子固定或溶液稀释，因此能够识别复杂生物过程中的各种分子行为和相互作用。
具体来讲，该团队在两个抗原纳米颗粒包覆的二氧化硅微珠之间构建了一个等离子体连接，以捕获额外的银纳米颗粒，在激光照射下形成一个动态纳米腔。这种纳米腔可以封装单个或几个分子，用于灵敏的SERS表征。由于光学等离子体俘获和SERS现象在空间上都限制在纳米尺度内，因此它超过了光学衍射极限，从而实现精确的位置控制，同时最大限度地减少检测体积并提高SERS的增强能力。此外，抗原纳米颗粒包被的二氧化硅微珠二聚体在溶液中比传统的抗原纳米颗粒组合更稳定，使得在常规显微镜上观察和定位等离子体结更容易，进一步提高了效率和重现性。
通过在“开”和“关”状态之间切换激光，研究人员可以控制光学等离子体捕获来调节动态纳米腔的组装和拆卸，以实现高通量采样和同步SERS测量。
研究团队通过这个高效的单分子平台，检测了与2型糖尿病相关的各种胰淀素。在2型糖尿病患者中，胰淀素有聚集和形成淀粉样原纤维的倾向。由于难以在动态混合物中检测异质胰淀素，导致聚集的分子机制尚不清楚。值得关注的是，该团队利用激光的开关控制，在单分子水平上探测混合物中的各种淀粉酶。基于等离子体的SERS平台为揭示pH依赖型淀粉样蛋白物种的异质结构和与2型糖尿病相关的淀粉样蛋白聚集机制提供了帮助。
研究人员通过结合光谱实验和分子动力学(MD)模拟，研究了不同生理pH条件下的胰淀素。借助该平台，他们在两种不同的生理条件下(pH 5.5和pH 7.4)收集了具有统计意义的大量SERS光谱，揭示了各种胰淀素物种的结构特征，最后在中性pH条件下淀粉样蛋白聚集的早期阶段发现了两种低密度的淀粉样蛋白。
研究结果表明，即使在pH值从7.4调整到5.5之后，不同种类的淀粉酶之间平衡的轻微变化也会导致不可逆的淀粉样蛋白发育。异质混合物中淀粉样蛋白种类的直接结构表征揭示了pH对淀粉样蛋白种类的分子内和分子间相互作用的影响，并为pH调节2型糖尿病淀粉样蛋白聚集背后的机制提供了理论基础。
通过去除集合平均，单分子技术可以辨别单个分子的信号，从而揭示以前看不见的细节，增加科学家对异质分子系统的科学理解。黄教授表示，他们的单分子平台可以获取大量的SERS谱图作为分子快照，与通过MD模拟获得的光谱相当。通过对单分子水平的结构细节进行统计分析，能够重建本体性质，并获得对异质混合物中特定分子类型的种群和概率的独特见解，有望揭开复杂生物系统中隐藏的奥秘。
