在突破衍射极限二十多年后，超分辨率显微镜领域继续为生物学家提供前所未有的利用光观察细胞内部的情况。自问世以来，诺贝尔奖获得者技术的空间分辨率已从几十纳米提高到一位数纳米范围。
现在，据报道，德国的研究人员开发了一种称为PicoRulers的新型参考结构，以更准确地估计超分辨率显微镜方法的空间分辨率。该团队认为，其基于多标记寡聚蛋白的PicoRulers与以前的参考结构相比具有多项优势，包括生物相容性、稳定性和模块化。
生物学相关的标尺
PicoRulers 的创建源于研究作者维尔茨堡大学的 Markus Sauer 和 Gerti Beliu 的愿望，即进一步提高超分辨率荧光显微镜的分辨率能力，尤其是在活细胞中。在他的研究中，Sauer 将超分辨率荧光成像应用于神经生物学和免疫学问题，而 Beliu 的实验室旨在利用新型生化化合物在不改变生物学功能的情况下进行化学计量荧光标记。
目前，较新的超分辨率显微镜方法的分辨能力通过DNA折纸结构得到证明，该结构允许在纳米距离处附着荧光团。然而，Sauer 和 Beliu 认为，细胞成像应用的评估应使用生物学相关的参考结构或尺子。
“我们的团队旨在创造生物相容的精确分子标尺，可以以纳米级精度校准最新的超分辨率显微镜技术，从而推动细胞分子领域成像分辨率的界限，”Sauer说。
面向研究人员的校准工具
研究人员设计了一种基于增殖细胞核抗原的蛋白质参考系统，它在DNA复制和修复中起着关键作用。PCNA由三个相同的多肽单元组成，内径和外径分别为3.4 nm和8.0 nm。
通过遗传密码扩增和点击化学，PicoRulers 将非经典氨基酸掺入 PCNA 蛋白的特定位置，即非自然遗传编码的氨基酸。这种修饰能够以最小的连锁误差实现有机染料的位点特异性附着。研究人员将三个ncAA插入到PCNA中，以明确的6 nm距离标记，并用四嗪染料和四嗪功能化的寡核苷酸标记它们。
最后，Sauer、Beliu和他们的同事采用称为DNA-PAINT的超分辨率显微镜方法成功解析了6 nm PicoRuler的规则三角形结构。总的来说，他们希望PicoRulers的开发将提供一种校准工具，以验证和提高新技术的准确性。
“我们的团队现在专注于扩大可用作PicoRulers的生物分子的范围，探索在生物成像中提供多样化应用的不同蛋白质或复合物，”Beliu说。“另一个方向可能是探索将PicoRulers递送到细胞中，可能通过显微注射或细胞穿透肽的功能化等方法，进行细胞内超分辨率成像实验。
