双光子显微镜(TPM) 能够以高分辨率对复杂生物过程进行深层组织成像。然而，可视化一些生物过程的能力，例如亚毫秒级的神经活动，除了高分辨率之外还需要高速成像。
为了解决这个问题，来自中国和德国机构的一组研究人员开发了一种高速 TPM 系统，科学家可以使用该系统以高时间分辨率和高空间分辨率观察非常快速的生物过程。
到目前为止，TPM 的性能一直受到其线扫描频率的限制，以每秒帧数 (fps) 衡量。线扫描频率是指激发激光沿一个方向扫描目标样品的速率。较慢的扫描频率会影响显微镜的整体 fps，因为它还决定了激光在另一个方向上扫过的速度。这导致显微镜的时间分辨率与其观察框架的大小之间的权衡。
在高速 TPM 中，研究人员通过结合两种激光扫描模式解决了这一权衡问题。
为了提高 TPM 的线扫描频率，研究人员使用二氧化碲 (TeO 2） 水晶。AOD 是一种特殊类型的晶体，其折射率可以通过声波精确控制。AOD 具有高声速，使激光能够在 2.5 µs 内扫描框架中的一条线。为了扩大显微镜的最大帧速率，研究人员采用了第二个 AOD 进行慢轴扫描。为了逐步放大，从种群视图到具有高空间和时间分辨率的亚细胞视图，研究人员将 AOD 与共振振镜扫描 (RS) 相结合。
使用 AOD 控制激发激光的扫描使激光转向比传统 TPM 中使用的检流计获得的速度更快。同时，切换到基于检流计的激光扫描机制的选项允许以可接受的分辨率和速度扫描样品的大区域，从而更容易在切换到 AOD 扫描之前定位感兴趣的小区域。
新型显微镜的最大线扫描频率为 400 kHz，在 250 × 40 像素下的最大帧速率为 10,000 fps。用户可以在各种扫描设置之间切换。
为了演示高速TPM，研究人员在基因工程小鼠身上安装了颅窗，并使用TPM观察神经元的形态和活动以及单个红细胞的运动。高达 10,000 fps 的帧速率足以精确测量钙在神经元树突中传播的速度，并可视化血管内单个红细胞的轨迹。实验结果还表明，增加线扫描频率会降低光漂白率。
实验表明，双光子显微镜中 AOD 和 RS 的组合提供了多功能性和精确性，以支持体内单个神经元活动和血液动力学的定量分析。高速 TPM 可用于复杂神经和血管系统的高分辨率、时间分辨的亚细胞研究，提高对这些领域的科学理解。
“基于 AOD 的扫描显微镜的新系统代表了成像速度和性能的显着提高，正如其在体内钙信号传播和血流测量中的应用所证明的那样，”加州大学伯克利分校教授 Na Ji 说，他也是Neurophotonics的副主编。
该研究发表在《神经光子学》上。
