为多光子成像设置寻找理想的超快激光源并非易事。它是峰值功率、脉冲能量和激光波长之间的良好平衡。在本白皮书中，我们讨论了重要的激光参数以及这些激光参数对结果质量的影响。
背景
多光子和高次谐波生成显微镜特别适用于高分辨率三维和活细胞成像，其中单光子技术受到离焦荧光背景和穿透深度的限制。基于多光子相互作用的成像技术，例如两个或三个光子激发和高次谐波生成，例如二次或三次谐波生成（SHG 或 THG）成像，已成为许多生物医学研究或临床诊断应用中非常有吸引力的工具，如它们提供高对比度成像能力，减少组织损伤，同时不一定需要人工诱导的荧光染料。
为了发生多光子激发，入射光子必须在同一时间和地点到达样品，以增加单个荧光化合物同时发生多光子吸收事件的概率，这意味着多光子激发的效率在很大程度上取决于脉冲期间入射光的峰值强度。因此，脉冲越短，峰值强度越高，产生的信号越强。
由于多光子显微镜和高次谐波成像中对光强度的非线性依赖性，信号也仅从焦平面内收集，并且激发光几乎不产生离焦发射。由此产生的受限多光子激发体积特别适用于活细胞成像，因为它可以产生更高的深度分辨率并显着减少样品的光损伤，从而延长细胞活力。
此外，由于散射较低，多光子成像中使用的较长波长增加了对样品的穿透深度。因此，对于需要对活细胞和组织进行深度穿透和成像的实验，多光子显微镜通常优于其他技术。多光子激发和高次谐波成像需要高峰值强度，这要求使用具有超短飞秒脉冲的锁模激光器。为了触发大量的多光子吸收事件，脉冲期间的光子密度必须比单光子吸收大几个数量级。先前发表的结果 [1, 2] 表明，比常用的 100-200 fs 脉冲持续时间更短的脉冲可以降低细胞致死率，并允许进行更长期的活细胞成像。
成像深度——更长的波长？
三维成像的最初考虑因素之一是所选激光波长下的样品透明度。在大多数组织中，由于组织的不均匀性，穿透深度受到光散射的限制。光在各向异性介质中发生散射，但较长波长比较短波长经历的散射较少，因此允许更深的光学切片、更大的穿透深度和对厚样品的三维成像。光散射（瑞利散射）与 1/λ 4 成比例，这意味着与 800 nm 相比，1050 nm 处的散射大约减少 3 倍。尽管更长的 NIR 波长（例如 1.3 µm 或 1.7 µm）会进一步降低光散射效应，但使用 1050 nm 左右的波长可以获得出色的深层组织显微镜检查结果。吸收 - 更短的波长？如图 1 所示，穿透深度的另一个挑战是样品内的吸收，尤其是水的吸收，并且对于更长的近红外波长越来越明显。用 D2O 交换水可以在一定程度上帮助缓解这种情况，但需要降低激光功率以避免加热样品。组织的主要化学成分是水，图 1 中水的吸收截面可用于帮助确定合适的激发波长。可以看出，可见光区域的吸水率最低。每毫米吸收 0.2% 的光，在 800 纳米附近也有一个局部吸收最小值。用 D2O 交换水可以在一定程度上帮助缓解这种情况，但需要降低激光功率以避免加热样品。组织的主要化学成分是水，图 1 中水的吸收截面可用于帮助确定合适的激发波长。可以看出，可见光区域的吸水率最低。每毫米吸收 0.2% 的光，在 800 纳米附近也有一个局部吸收最小值。用 D2O 交换水可以在一定程度上帮助缓解这种情况，但需要降低激光功率以避免加热样品。组织的主要化学成分是水，图 1 中水的吸收截面可用于帮助确定合适的激发波长。可以看出，可见光区域的吸水率最低。每毫米吸收 0.2% 的光，在 800 纳米附近也有一个局部吸收最小值。
然而，对于三光子显微镜，800 nm 的波长会带来问题，即样品发出的信号处于 UV 范围内 (800/3 nm = 266 nm)，这在反射检测中是一个重大挑战，其中发射的光以相同的方式传播作为激发光的路径。来自样品的发射光穿过聚焦激发光的同一显微镜物镜，激发光通常具有有限的紫外线透射，尤其是低于 350 nm。因此，对于落射检测，应选择足够长的波长以最大程度地减少光散射并避免三阶信号的紫外线传输不良，但又应选择足够短的波长以最大程度地减少水的吸收。因此，就散射和吸收而言，使用约 1050 nm 的中心波长可提供最佳条件。此外，通过使用非常短（低于 50）fs 的脉冲，
避免发热——降低平均功率
水在 1050 nm 附近的光吸收量约为每毫米路径长度的 2%，这是相当可观的，但仍比 1700 nm 低几个数量级。在 1050 nm 处，将 100 mW 平均功率聚焦到 0.5 x 0.5 mm2 的视场 (FOV)，这会导致局部热沉积为每 mm3 (0.02 * 100/0.5*0.5) 8 mW，这可能会导致温度每秒增加约 2 度（水的比热：4.2 Jg-1.K-1）[5]。对于大多数组织来说，当温度升高 1 度时不会产生重大问题，但对于更敏感的组织，例如含有空气的肺组织，由于空气膨胀，样本可能会表现出明显的“动态变化”。此外，在该功率下，长时间暴露于单个区域会导致所有组织出现热问题。使用较小的 FOV，平均功率沉积在较小的体积上，并且热能增加并与 FOV 面积成反比 [5]。幸运的是，在 0.5 mm 的长度尺度上，热扩散也发生在秒级的时间尺度上（组织的热扩散常数约为 0.1 mm2 /s），这有助于散热。然而，对于高平均功率，以足够快的速度去除产生的热量以避免在组织中引起热问题或损伤不可避免地是一个挑战。因此，以尽可能低的平均激光功率实现最佳图像质量具有重要意义。有助于散热。然而，对于高平均功率，以足够快的速度去除产生的热量以避免在组织中引起热问题或损伤不可避免地是一个挑战。因此，以尽可能低的平均激光功率实现最佳图像质量具有重要意义。有助于散热。然而，对于高平均功率，以足够快的速度去除产生的热量以避免在组织中引起热问题或损伤不可避免地是一个挑战。因此，以尽可能低的平均激光功率实现最佳图像质量具有重要意义。
为什么低于 50 fs 的脉冲会产生更亮的信号
对于给定的平均功率，将脉冲持续时间从 200 fs 减少四倍到 50 fs 将导致峰值功率（或峰值强度）高 4 倍。多光子和高次谐波信号非线性地依赖于激光峰值功率。高强度增加了同时发生多光子吸收事件的可能性，并且 SHG 和 THG 信号分别与入射光强度的平方和立方成比例。因此，相应的信号增加对于激光峰值功率的增加是实质性的。因此，超短亚 50 fs 脉冲可显着提高多光子效率和高次谐波产生效率，从而显着提高图像亮度。
要通过实验应用此关系，必须准确确定样品的脉冲持续时间。如果显微镜光学器件中的色散没有得到适当补偿，脉冲将被拉伸，并且样品处将测量到较低的峰值功率。在这种情况下，脉冲持续时间与高次谐波产生效率之间的关系无法通过实验准确验证。为了生成足够的非线性 SHG 和 THG 信号以在对样品温和的平均功率水平下达到所需的信噪比，低于 50 fs 的脉冲和色散预补偿的使用是必不可少的。
在图 3b 中，激光器的光谱带宽被限制为 10 0 4 8 12 16 20。图 3a 显示了来自约 1064 nm 的 calibnm FWHM 的三次谐波信号，产生约 160 fs 脉冲。图 3a 和 3b 中的图像缩放比例相同，但图 3b) 未显示 THG 信号。只有在从较长的 ~160 fs 脉冲重新调整较低的 THG 信号后，才有可能获得高于实验本底噪声的图像，如图 3c 所示。在这种情况下，需要高 2.5 倍的平均激光功率才能实现与从较短的亚 50 fs 脉冲获得的 THG 信号相当的信噪比。总之，超短亚 50 fs 脉冲可提供相当高的脉冲峰值功率，从而以低得多的平均功率产生最佳信噪比图像，从而减少光漂白，并在样品上使用 4.7 mW 的平均功率扩展细胞活力网格，使用 VALO 系列飞秒激光器的全带宽，产生约 40 fs 脉冲。在图 3b 中，激光器的光谱带宽被限制在 10
强脉冲——THG 的优势
THG显微镜是一种高分辨率的深光学切片和无标记成像技术，组织损伤小，不需要人工诱导的荧光探针，但它需要更高的峰值功率和更短的脉冲，同时保持较低的平均激光功率以延长细胞可行性。内源性生物分子的发射和自然发生的二次谐波信号对某些发色团具有化学特异性，并且仅在非中心对称分子（如胶原蛋白）中产生。THG 信号的化学特异性要低得多，折射率的每个空间变化都能产生 THG 信号。因此，THG 显微镜可以看作是相差显微镜 [6] 的 3D 等价物。尤其，折射率的局部变化在激光焦点尺寸的一半以内对于生成 THG 信号特别有效。由于焦点中的 Gouy 相移，焦点前后的激光场异相 180 度。对于所有三阶（和奇数阶）信号也是如此，其中信号具有破坏性干扰并抵消。因此，THG 信号不会在均匀介质中产生，并且需要在焦点内出现对称性破缺。由于这一普遍原理，可以观察到细胞和亚细胞的细节，一些微弱的和 信号具有破坏性干扰并抵消的地方。因此，THG 信号不会在均匀介质中产生，并且需要在焦点内出现对称性破缺。由于这一普遍原理，可以观察到细胞和亚细胞的细节，一些微弱的和 信号具有破坏性干扰并抵消的地方。因此，THG 信号不会在均匀介质中产生，并且需要在焦点内出现对称性破缺。
分子在光漂白之前经历几个激发/发射循环，一些可能更敏感，而另一些可能在额外的入射光子无法激发更多分子之前执行几个循环。在延时显微镜中，光损伤是长时间观察活细胞或组织时的主要限制因素之一。虽然光毒性是分子结构和实验环境的函数，但它不可避免地会因持续暴露在高平均激光功率下而加速。因此，对于对光毒性敏感的活细胞成像，低于 50 fs 脉冲提供的低平均激光功率和高峰值功率相结合，可增强细胞活力并显着延长成像时间。如表 1 所示，比较 50 fs 和 200 fs，相同峰值功率所需的平均功率输出仅为四分之一的激光器，这意味着更长的成像持续时间，同时提供相同的双光子效率 (TPEF)。为了达到尽可能低的平均功率，较低重复率的激光器是首选，这也有助于减少光漂白效应。
