多光子激发显微镜已从 30 多年前展示其潜力成功转变为整个生命科学中使用的强大成像方法。这种广度反映在一系列现代技术中，包括双光子或三光子激发荧光显微镜、相干反斯托克斯拉曼散射和谐波产生显微镜。该技术已应用于一系列应用，从神经科学等领域的研究到用于药物开发和临床前目的的细胞活力分析评估。超快激光系统的持续发展有助于将MPE带入新的领域。
超快激光器是支撑所有MPE显微镜方法的关键组件。MPE 显微镜的关键领域包括活体组织成像，特别是在神经科学中，成像深度、速度和多功能性很重要;紧凑型固定波长激光器可以完全集成到仪器中的临床前和专业应用;以及新兴应用，这些应用需要在更长的波长下获得更高的功率。
活体成像
MPE显微镜历来纯粹用作一种研究方法，使用多光子显微镜的研究长期以来一直得到超快激光振荡器的支持。多年来，这些激光器都是基于钛：蓝宝石增益介质技术。神经科学研究是MPE研究最主要的应用之一，对更长波长的需求能够对活组织进行更深入的成像，这是飞秒激光器开发的关键驱动力，飞秒激光器结合了镱增益介质和光学参量振荡器技术。这可以提供更宽的倍频程跨度波长调谐范围。这两种激光技术在各自的应用中各有其关键优势。
激光制造商继续致力于改进，以便能够以更快的帧速率从组织样本的更深处捕获更明亮的图像。某些公司通过集成功能来实现这一目标，以解决激光器和显微镜之间具有挑战性的技术差距。这种改进积分的途径始于群速度色散预补偿。简而言之，激光束路径中显微镜元件和其他透射光学器件的累积色散会导致激光脉冲在时间上拉伸——甚至更深的组织样本也会增加总群速度转移效应。
然而，要获得更明亮、对比度更高的图像，本质上需要更短的脉冲和高峰值功率。因此，激光制造商在激光系统内集成了预补偿光学器件，以相反的群速度色散预拉伸脉冲，以完全补偿位于光路和显微镜本身中的所有透射光学器件。这允许在采样平面上获得最短的脉冲宽度。色散预补偿量现在只是用户的一键式选择。这一特性变得更加重要，因为显微镜本身也经过调整，可以实现更快的图像采集或更大的视场。
控制功率 提高成像性能并提供更简单的系统操作的最新集成功能是快速功率
调制，低至微秒级时间尺度。即使在简单的光栅扫描实验中，这也是最佳性能的要求，在这种实验中，当显微镜扫描头返回光束光斑以进行下一次 y 扫描时，激光功率应完全脱离。功率调制对于扫描大型 z 轴堆栈的应用更为重要;当系统更深入地聚焦到组织中时，自然衰减决定了使用更高的激光功率来保持恒定的图像强度。在日益复杂的高速扫描协议中，功率控制也可用于保持相对于体素停留时间的最佳功率水平。
直到最近，功率调制通常需要在激光器和显微镜之间使用外部调制器。可以使用两种类型的调制器设备：声光调制器或电光调制器。声光调制器更可靠，支持更高对比度的调制，但电光调制器通常是首选，尤其是在自制解决方案中，因为它们更容易设置。现在，激光器制造商基于性能更好的声光调制器，将此功能作为无缝集成的可选功能提供给激光器。这种交钥匙功能可以称为总功率控制。
多模态应用 多模态应用
和临床前环境的增长表明，MPE显微镜在从一种新的科学询问方法到主流成像技术的旅程中已经走了多远。多模态应用包括将MPE显微镜与另一种成像方法相结合的仪器和实验。这些应用与肿瘤学和其他医学领域的其他新兴临床前应用有很大不同，但它们对先进的激光源有着共同的需求。与专为MPE研究而设计的具有全套功能的多功能激光器相比，这些应用可以受益于紧凑的按钮飞秒源。这体现在Coherent的Axon系列激光器中，这些激光器提供单波长输出，但由于其非常短的脉冲宽度和内部群速度色散预补偿，它们仍然驱动高对比度、高分辨率图像的采集。这样可以最小化样品的脉冲宽度。它们还提供集成声光调制器选项。
当然，单波长激光器的一个关键问题是：什么波长?这是通过在现有激光材料和频率谐波/移位晶体的实际限制范围内密切匹配重要应用的需求来确定的。输出波长为 780 nm 的激光器就是一个很好的例子。
激发荧光的应用 人们对显微镜学科的兴趣日益浓厚，即使用来自重要代谢物的早期荧光
信号，例如还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸，它们可以在紫外范围内通过单光子吸收激发。这些分子的荧光可以指示细胞活力的细节，特别是细胞如何“燃烧”糖来产生能量。健康细胞通过称为氧化磷酸化的过程产生大部分能量，其中能量通过嵌入线粒体中的一系列蛋白质复合物来利用。许多癌细胞和其他有缺陷或受害的细胞从称为糖酵解的低效过程中获取能量，其中葡萄糖转化为丙酮酸。FAD量相对于NADH的比值称为氧化还原比，并被公认为揭示哪个过程占主导地位的指标。这在肿瘤患者的临床分析和药物发现工作中是有价值的信息。
NADH 和 FAD 的早期 MPE 成像使用两种不同的波长来匹配这两个靶标的最大吸收。但这需要使用两个飞秒激光器的高成本，或者可调谐激光器的复杂性。幸运的是，弗吉尼亚大学教授Ammasi Periasamy等研究人员已经证明，在780nm处的单个中间波长可以同时激发足够的效率，以提供最重要的氧化还原比1。因此，激光制造商通过开发该特定波长的紧凑型单波长激光器来应对。
为了完整起见，应该注意的是，这需要仔细的光谱滤波以避免串扰，从而使用两个光电探测器分别检测来自两种物质的荧光。但与使用两个超快激光器相比，这是一种相对简单和经济的适应。780 nm 波长也非常适合另一种无标记成像技术，即用于成像胶原纤维的二次谐波产生。除了 780 nm 波长外，还提供 920 nm 和 1064 nm 波长的激光器，它们都具有相同的形式、配合和功能，涵盖关键流行的非线性成像光谱窗口。
如前所述，神经科学和活体成像领域的研究人员正在寻求更深入地对活组织进行成像，这可以通过使用更长的波长来实现。2P成像的最大成像深度取决于组织类型以及研究人员愿意容忍的平均信号量。它还取决于激发波长的选择，而激发波长受限于与可用荧光探针和蛋白质的匹配。
在脑组织中，2P激发荧光方法的实际极限为<1 mm。对于研究模型小鼠大脑的神经科学家来说，这种限制变得越来越令人沮丧，因为小鼠皮层的总深度为 ~0.9 mm，从而将 2P 成像限制在该区域。此外，皮层正下方的区域具有更高的散射，将散射长度减小到形成皮层的灰质的~40%。因此，使用2P显微镜进行皮层以外的成像是不切实际的。
然而，早在 2013 年，康奈尔大学的 Chris Xu 教授及其同事就证明，通过使用 ~1300 nm 或 1700 nm 的激光，3P 激发可以为脑成像提供更大的深度，这与绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的 3P 吸收峰非常匹配2。
他们指出，3P激励机制的效率低于2P激励，因此3P会产生更弱的信号。然而，他们解释说，更深成像的关键成像指标不是原始信号强度，而是信噪比。与 2P 激发相比，对激光功率的高阶依赖性实际上导致 3P 荧光的面外激发较低。结果，他们表明，在某些情况下，3P的信噪比可能比2P高出三个数量级。这支持在 2 mm 及以上的深度进行成像，具体取决于激光功率和占空比。3P成像的示例显示在开头的图像中。
激光技术推动应用
3P的激励效率较低，需要比2P高得多的峰值功率;因此，为2P开发的超快激光器不能用于诱导样品中三个光子的吸收。使用钛蓝宝石振荡器-放大器设置可以达到高峰值功率，但在实际时间范围内获取图像也要求高重复频率和数十瓦的高平均功率。对于基于钛蓝宝石的激光器系统来说，这种组合根本不是一个实用的选择。
在过去的几年里，有两个方面改变了3P激励的环境。首先，越来越多的研究人员对这种技术及其超越小鼠皮层的能力产生了兴趣。这创造了对合适激光源的商业需求。其次，同样重要的是，放大的镱激光器已经成功开发。这些掺镱放大器现在可以提供数十瓦的输出和高达 50 MHz 的重复频率。通过将其中一个放大器与市售的可调谐光学参量放大器相结合，并相应地降低重复频率，可以生成具有适合 3P 成像特性的 1300 nm 和 1700 nm 范围内的激光。然而，这种双盒长波长生成方法存在固有的复杂性，并且缺乏集成的功率调制和色散预补偿，而3P激励比2P激励更需要这些预补偿。
为了支持3P在大脑成像中的广泛应用，应开发一种一体式激光源，其中掺镱放大器和光学参量放大器集成在一个紧凑的， 简单的平台。为了帮助简化该技术，Xu的团队最近表明，虽然1300nm激光是激发GFP的理想选择，但它也可以激发RFP和其他一些具有足够信背景比的长波长探针，用于成像3。这使得激光制造商能够定义专为 3P 激发显微镜而优化的一体式单波长 1300 nm 光源。
扩大MPE
的使用 总而言之，多光子显微镜是一个动态领域，其特点是技术和应用多种多样。它的持续增长取决于让尽可能广泛的用户能够使用它，而不仅仅是激光专家。激光制造商将继续与尖端用户密切合作，以跟上所有关键发展，并通过新的激光器和创新的激光功能来支持这些发展。
